真菌毒素是丝状真菌产生的一组有毒次生代谢产物，由于真菌毒素的热稳定性和化学稳定性极强，高温烹饪、工业加工都不会造成其结构性质的破坏或分解，因此食物中可能存在真菌毒素，对动物或人健康有很大危害。赭曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）是广泛存在于食品中的真菌毒素，会对人体的肝脏、肾脏和免疫系统产生不良影响。
江苏农牧科技职业学院食品科技学院的祁兴普和扬州大学食品科学与工程学院的董骐玮、李倩*等利用具有分支状纳米花瓣结构的金纳米花（AuFL）为载体，以特异性识别的核酸适配体为分子识别元件，基于新颖的AuFL、核酸适配体和修饰有荧光染料的DNA制备一种新型功能纳米探针。结合荧光技术，利用功能纳米探针上两种荧光染料供体和AuFL受体之间的FRET和靶标诱导的荧光恢复，构建一种简单、新颖的双信号荧光适配体传感器用于同时检测OTA和ZEN。红酒中的真菌毒素是研究热点，本研究采用红酒作为样品，验证基于AuFL的双信号适配体传感器检测技术检验效果，以期为利用功能探针进行多种毒素检测提供新思路。
基于双荧光信号对OTA和ZEN同时检测的原理如图1所示。R1和R2为修饰有巯基的单链DNA，且部分序列可互补杂交（黑色部分），不互补的部分分别含特异性识别OTA（绿色部分）和ZEN（红色部分）的适配体。F1和F2为与OTA适配体和ZEN适配体互补的单链DNA，且分别修饰荧光染料FAM和Cy3，作为FRET过程的两个不同的能量供体。首先，制备了AuFL作为能量受体，通过Au-S键将R1和R2组装在AuFL表面；然后，加入互补链F1和F2进行碱基互补配对，将F1和F2组装到AuFL表面形成DNA功能化纳米探针。适配体和互补链之间的杂交反应使两种荧光染料（FAM和Cy3）和AuFL之间距离足够接近，引起供体向受体的能量转移。因此，由于FRET的发生，导致FAM和Cy3荧光的猝灭，纳米探针溶液自身无荧光。当加入OTA后，OTA和R1上的适配体特异性结合，R1-F1双链发生解离，导致修饰有FAM的F1从探针上脱落和FRET过程的中断，518 nm波长处FAM的荧光得到恢复。当加入ZEN后，ZEN和R2上的适配体特异性结合，R2-F2双链发生解离，导致修饰有Cy3的F2从探针上脱落和FRET过程的中断，570 nm波长处Cy3的荧光得到恢复。因此，通过利用两个供体和单个受体的双信号FRET和靶标诱导的荧光恢复，可以实现基于荧光“关-开”的方式同时检测OTA和ZEN。
如图2所示，首先，通过种子生长方法制备了平均粒径为50 nm的AuNPs，其在530 nm波长处具有最大吸收峰，形状为明显的球形结构，且具有良好的单分散性和均匀的尺寸。然后，在AuNPs溶液中加入盐酸多巴胺和氯金酸制备得到AuFL，通过TEM和SEM对其形貌进行了表征。如图3A、B所示，AuFL相比于AuNPs表现出明显的形态变化，具有高度分枝的花瓣结构，且同样显示出良好的单分散性和均匀的尺寸。最后，通过在AuFL表面修饰4 条DNA（R1、R2、F1、F2）得到DNA功能化纳米探针。如图3C紫外光谱所示，AuFL在595 nm波长处有一个特征吸收峰，而DNA功能化纳米探针显示出两个特征吸收峰：一个位于260 nm波长处，对应偶联DNA的吸收峰；另一个位于595 nm波长处，对应AuFL的吸收峰。通过测定FAM和Cy3的荧光发射峰，验证了两者和AuFL发生FRET的可行性，如图3C所示，AuFL在350～700 nm范围内有较宽的紫外吸收峰。FAM的发射峰位于518 nm波长处，Cy3的荧光发射峰位于570 nm波长处，均与AuFL较宽的紫外吸收峰发生一定程度重叠，表明AuFL可以有效地猝灭FAM和Cy3的荧光。另外，DNA杂交反应使两种荧光染料和AuFL之间距离足够接近，引起供体向受体的能量转移。如图3D所示，纳米探针负电荷比AuFL更多，这表明带负电荷的DNA在AuFL上成功组装。为了测得AuFL上DNA的结合量，通过100 ℃高温加热解开DNA双螺旋结构，并根据上清液中DNA的荧光强度，计算得到单个AuFL上F1和F2的量分别为335 条和355 条。以上实验证明了DNA功能化纳米探针的成功制备。
基于纳米探针溶液体积、检测溶液pH值、检测时间会影响适配体和OTA/ZEN的结合，因此本研究对检测溶液体积、溶液pH值、检测时间进行了优化。本实验中使用的荧光吸收池最低检测体积是200 µL，首先考察了不同纳米探针溶液体积实现OTA和ZEN检测的最低质量浓度，如表1所示。随着探针溶液体积的升高，OTA和ZEN检测的最低质量浓度逐渐升高，因此选取200 µL的探针溶液体积为最优探针体积。如图4A、B所示，不同检测溶液的pH值对FAM和Cy3的荧光恢复效果差异显著（
＜0.05）。随着缓冲溶液pH值的增大，FAM和Cy3的荧光恢复强度逐渐增大，在pH 7.4时达到最大值。当pH值继续升高，荧光恢复强度开始明显减弱。因此，选取7.4为检测溶液的最佳pH值。图5A、B为检测时间对纳米探针的荧光响应，检测时间由0 min延长到60 min时，在518 nm波长处FAM的荧光强度以及570 nm波长处Cy3的荧光强度随着检测时间的延长均逐渐增大；检测时间超过60 min后，荧光强度均趋于稳定，FAM和Cy3完全脱离纳米探针。因此，选取60 min为最优检测时间。
在最优检测溶液pH值、检测时间条件下，构建了双信号荧光适配体传感器，考察不同质量浓度OTA和ZEN加入后，518 nm和570 nm波长处的荧光响应情况。如图6所示，随着OTA质量浓度的增大，检测溶液位于518 nm波长处的FAM荧光逐渐恢复，这是由于高特异性的适配体和OTA结合导致FAM从纳米探针释放的结果。在0.05～500 ng/mL质量浓度范围内，检测溶液在518 nm波长处的荧光强度（FL518nm）与OTA质量浓度的对数之间呈现良好的线lg
OTA （OTA质量浓度单位为ng/mL），R2 ＝0.998，检出限为0.017 ng/mL。如图7所示，检测溶液位于570 nm波长处的Cy3荧光强度随着ZEN质量浓度的增加而连续增加，同样是由于高特异性的适配体和ZEN结合导致Cy3从纳米探针释放的结果。0.1～500 ng/mL质量浓度范围内，检测溶液在570 nm波长处的荧光强度（FL 570nm ）与ZEN质量浓度的对数呈线lgZEN （ZEN质量浓度单位为ng/mL），R2 ＝0.995，检出限为0.033 ng/mL。因此，所构建的双信号荧光传感器可以实现对OTA和ZEN的定量检测，且具有较高的灵敏度和优异的性能（表2）。
在实际样品检测中传感器的选择性至关重要。为了评估双信号荧光适配体传感器的选择性，选用了3 种潜在的干扰物质——伏马毒素B 1 （FB 1 ）、黄曲霉毒素B 1 （AFB 1 ）、赭曲霉毒素B（OTB）进行实验。5 μg/mL上述开云真人 官网干扰物、100 ng/mL OTA、100 ng/mL ZEN分别加入检测溶液并进行测定。如图8所示，相比于加入OTA和ZEN后检测溶液荧光恢复显著，加入其他干扰物质检测溶液基本没有荧光变化，这证明该双信号荧光适配体传感器具有良好的选择性和抗干扰能力。
所制得的双信号荧光适配体传感器通过采用标准加入法，检测了处理过的红酒中的OTA和ZEN。实际样品检测结果如表3所示，相对标准偏差（RSD）和回收率（OTA为95.0%～97.4%，ZEN为92.0%～94.0%）符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》 要求。结果证明了该双信号荧光适配体传感器检测的准确性，可用于实际样品中OTA和ZEN的检测。
本实验基于AuFL供体和两种荧光染料受体之间的FRET机理，构建了一种双信号荧光适配体传感器用于OTA和ZEN的检测。该传感器对OTA和ZEN检测具有高灵敏度、选择性和准确性，可通过显著的荧光变化进行定量分析。在最优条件下，对OTA的检测范围为0.05～500 ng/mL，检出限为0.017 ng/mL。对ZEN的检测范围为0.1～500 ng/mL，检出限为0.033 ng/mL。此外，该传感器还成功地应用于红酒样品中OTA和ZEN的同时检测。OTA回收率为95.0%～97.4%，ZEN回收率为92.0%～94.0%，相对标准偏差小于5.2%。这种基于双荧光信号响应构建的适配体传感器在真菌毒素的同时检测方面具有巨大潜力。
本文《基于金纳米花的双信号适配体传感器检测红酒中真开云真人 官网菌毒素》来源于《食品科学》2023年45卷第2期308-314页，作者：祁兴普，董骐玮，朱麟菲，邹婷婷，郑 义，张婧怡，李 倩。DOI:10.7506/spkx0418-179.。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南师范大生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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